早年为沛县卒史，刘邦起兵后追随 周昌是秦末泗水郡沛县人，他与堂兄周苛都曾担任泗水郡卒史。刘邦于沛县起兵后，出兵北上薛县，先后击败了泗水郡的郡监平和郡守壮，夺取了薛郡南部的胡陵和方与，周昌于是和堂兄周苛一起投奔刘邦。 投奔刘邦之后，周昌最
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周昌是秦末泗水郡沛县人，他与堂兄周苛都曾担任泗水郡卒史。刘邦于沛县起兵后，出兵北上薛县，先后击败了泗水郡的郡监平和郡守壮，夺取了薛郡南部的胡陵和方与，周昌于是和堂兄周苛一起投奔刘邦。
投奔刘邦之后，周昌最初只是负责管理旗帜，而堂兄周苛也只是作为宾客，此后刘邦奉楚怀王熊心之命西进灭秦，两人一路跟随刘邦作战。一路征战下来，刘邦的兵力不断扩充，凭借着丰沛嫡系的身份，周昌和周苛的地位也是水涨船高。
西进灭秦之后，项羽大封天下，刘邦获封汉王，周昌凭借一路西征所立战功，被任命为中尉，中尉乃是秦汉时期掌管禁军的高级武官，如此可见刘邦对其信任，而其堂兄周苛也被任命为了御史大夫。
汉三年（前204年）五月，项羽围攻荥阳，刘邦命周苛、枞公留守荥阳，自己则自荥阳逃回关中。同年八月，项羽攻破荥阳后，本想招揽周苛但周苛却痛骂不降，遂被项羽烹杀。
周苛被杀之后，刘邦感念于他的功劳，便任命堂弟周昌继任御史大夫一职。刘邦称帝建国之后大封功臣，周苛于汉六年（前201年）正月与萧何、曹参等人一起受封，周昌被封为汾阴侯，周苛之子也因父亲功劳被封为高景侯。
刘邦立国之后，沿用秦朝的“三公九卿制”，周昌依旧担任三公之一的御史大夫，主要负责监督百官。由于周昌为人坚忍刚强，敢于直言不讳，因此就连丞相萧何都对周昌极为敬畏。
一次，周昌进宫奏事，正好遇到刘邦与戚夫人在亲热，周昌被吓得扭头就跑，刘邦却连忙追上去，骑在周昌的脖子上道，“你看我是什么样的皇帝？”
周昌见刘邦没个正型，便没好气的回道，“陛下您就是个夏桀、商纣一样的皇帝”。刘邦听了这种讥讽之语也是毫不在意，只是哈哈大笑。
汉九年（前198年），刘邦由于吕氏外戚势力太大，而太子刘盈又性格仁弱，便想改立刘如意为太子。然而，由于当时朝堂上以丰沛元从功臣资历最老、地位最高，而他们早年便与吕后相识，在戚夫人与吕后之间自然更倾向于吕后。
因此，刘邦的易储之举，几乎遭到了举朝上下的反对，不过这些大臣虽然反对，但却只有周昌敢在朝堂上当面顶撞刘邦，虽然周昌因紧张而口吃，但却公然表示，即便刘邦以皇帝之尊下令更换太子，他周昌也敢拒绝接受诏令。
吕后在东厢听到周昌在朝堂上的对答后，事后甚至对周昌跪谢道，“若不是您据理力争，太子恐怕就要被废掉了”。
由于大臣们的激烈反对，再加上在张良建议下请来士子阶层的领袖“商山四皓”，刘邦在朝野内外的压力之下，最终放弃了改立太子，下令年仅八岁的赵王刘如意前往赵国就封。
刘邦虽然放弃了易储，并且让刘如意前往封地就国，但仍然担心自己百年之后，刘如意会遭到报复，为了保全儿子的性命，刘邦在赵尧的建议下，最终选择任命周昌为赵国丞相，辅佐刘如意自立封地的同时，尽量保全刘如意的性命。
汉十二年（前195年）四月，刘邦驾崩，刘盈继位，吕雉以太后之尊干涉朝政，随即便对戚夫人展开清算，戚夫人不久便被吕后囚禁于永巷，不仅限制了人身自由，而且每天还得劳动。
根据《汉书·外戚传》的记载，其实吕后一开始并没有想要杀死赵王刘如意，但戚夫人被囚禁后，却做了一首《戚夫人歌》，“子为王，母为虏。终日舂薄暮，常与死为伍。相离三千里，当谁使告女”。吕后得知之后，见戚夫人竟然还想向儿子求救，这才开始派人召赵王刘如意入京。
赵相周昌知道刘如意一旦入京，必然不会有好结果，因此多次以刘如意身体不好为由，阻止刘如意入京。吕后见三番五次皆被周昌所阻，于是派人召周昌入京，周昌入京拜见吕后，吕后怒骂道，“难道你不知道我痛恨戚夫人吗？你为何不让赵王进京？”
周昌被调回京城后，吕后再派人召刘如意，失去了周昌保护的刘如意，没有理由再次拒绝，只好乖乖返回京城。刘如意入京之后，虽然有惠帝刘盈的保护，但吕后还是趁着一次刘盈清晨外出，刘如意仍在熟睡的机会，派人将刘如意毒杀。杀死刘如意后，吕雉又命人将戚夫人做成人彘。
刘如意被杀之后，周昌自认辜负了高祖刘邦的嘱托，一生性格强硬的他，虽然无力对抗大权在握的吕后，但却就此称病引退，不再上朝参政，也不再拜见吕后，以此作为无声的对抗。三年之后，心灰意冷的周昌最终郁郁而终。
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